“菲”常有道 | 菲鵬生物免疫診斷試劑原料開發(fā)經(jīng)驗分享
7月20日，由全國體外診斷網(wǎng)（CAIVD）主辦的《破勢?免疫診斷試劑抗原抗體自研自產(chǎn)研討會》云會議取得全滿成功，菲鵬生物項目研發(fā)總監(jiān)郭亮博士受邀參加了本次研討會，并從不同檢測方法學對核心原料的選擇、抗原開發(fā)的核心問題及優(yōu)化技巧、抗體開發(fā)過程中面臨的問題及穩(wěn)定性優(yōu)化策略等內容分享了菲鵬生物對于免疫診斷試劑原料開發(fā)的認識和經(jīng)驗。
PART 01
不同檢測方法學對核心原料的選擇
目前常用的免疫檢測方法包括四種：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學發(fā)光免疫分析（CLIA）、層析免疫分析（LFIA）、乳膠增強比濁免疫分析（LETIA），不同的檢測方法都遵循免疫反應的底層原理，即抗原抗體親和反應，不同檢測方法學對抗原抗體的應用方法不同，所以對抗原抗體的要求也不同。
如ELISA對于被固定或帶檢測標記物的抗原或抗體有很高的生物活性和純度要求，抗體多采用單抗，一些廠商為提高抗體特異性，會采用酶切后的抗體片段如不包含F(xiàn)c的F(ab')2片段。
CLIA既可采用單克隆抗體，也可采用多克隆抗體。但需要注意的是，由于我們通常使用的是兔抗或鼠抗原料，對某些臨床樣本會產(chǎn)生非特異性反應。因為樣本中可能存在針對動物免疫球蛋白的抗體，所以會在雙單克隆夾心法模式中產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象。
PART 02
抗原開發(fā)的核心問題和優(yōu)化技巧
在抗原開發(fā)過程中，蛋白質樣品的純度水平?jīng)Q定其對下游測試的影響，因此蛋白純度一般是原料廠商最關心的核心問題。而蛋白表達純化的得率、檢測中的活性和原料的穩(wěn)定性都與蛋白純度有著密切關系，因此對蛋白純化工藝的優(yōu)化可從以上三方面進行考慮。
包涵體的純化和復性折疊策略
包涵體是蛋白表達過程中經(jīng)常遇到的現(xiàn)象，如果我們無法通過優(yōu)化蛋白表達來解決包涵體問題，只能通過摸索不同復性工藝，使蛋白重新折疊形成類似天然的二級結構。菲鵬生物在此分享幾點在蛋白純化過程中形成包涵體和對其復性折疊的策略：
首先我們可通過同源蛋白數(shù)據(jù)模擬分析或其他已有的文獻數(shù)據(jù)來了解目的蛋白的二級結構特點，之后根據(jù)二級結構來選擇適合的復性溶解試劑，同時也要考慮溶解劑的去除對下游工藝或作為免疫原的影響，有時還需要將不同溶解劑串聯(lián)使用，例如：使用提高pH促溶掛柱，洗脫后立即用帶有DMSO的緩沖液中和pH，從而穩(wěn)定復性后的正確折疊。
圖源：Singh, A., Upadhyay, V., Upadhyay, A.K. et al. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact 14, 41 (2015).
常用表面活性劑使用策略
在提取過程中使用表面活性劑也是提高抗原或抗體活性和穩(wěn)定性的一種方法。菲鵬生物總結了不同表面活性劑的物理性質（如下圖），在使用過程中需要從溫度、類型、使用濃度、溶解目標和下游檢測影響等進行綜合考慮。例如：SDS是一種強陰離子表面活性劑，容易破壞蛋白，且難以去除，使用時需謹慎；Digitonin可溶解真核細胞膜，但不能溶解原核細胞膜；Triton X-100可溶解細菌內膜但不能溶解細菌外膜，此外，Triton X-100還能夠吸收紫外線，對下游檢測會有影響等。
PART 03
抗體開發(fā)過程中面臨的問題及穩(wěn)定性優(yōu)化策略
原料廠商在抗體開發(fā)過程中經(jīng)常會遇到免疫動物效價低、抗體陽性率高但親和力不夠以及抗體穩(wěn)定性差等問題。雖然我們可以通過不同抗體發(fā)現(xiàn)路徑找到活性高的抗體，但作為試劑開發(fā)的原料，抗體的穩(wěn)定性起決定性作用。
抗體的穩(wěn)定性品控可從濃度、純度、活性和外觀來考量。關于如何提高抗體的穩(wěn)定性，菲鵬生物建議從抗體工程和生產(chǎn)工藝優(yōu)化兩個方向進行優(yōu)化。
此外，抗體穩(wěn)定性評估還需要借助多種檢測手段來綜合分析。菲鵬生物總結了八種常用的抗體檢測技術，如通過表面等離子體共振技術（SPR）分析發(fā)現(xiàn)，抗體的親和力能夠決定試劑檢測的靈敏度；動態(tài)光散射（DLS）可用于考察抗體的穩(wěn)定性；抗體純度可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）、體積排阻色譜（SEC-HPLC）、十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（CE-SDS）三種方式進行確認；毛細管等電聚焦電泳（CIEF)是檢測分析抗體電荷異構體的有效手段。
常見問題解答
抗原表達的構建設計有哪些優(yōu)先考慮的建議？
抗原開發(fā)首先要熟悉目的蛋白信息，包括結構、功能和生理基質等，這些信息在構建設計時都可以利用或回避。另外，表達單一結構域還是全長、載體的選擇和表達宿主的選擇都是可以優(yōu)先考慮的。例如，基于病原體靶蛋白的研究來選擇結構域，或考慮表位篩選及選擇嵌合表位來優(yōu)勢互補；選擇合適融合蛋白也是常用的手段；如果表達的抗原在檢測中出現(xiàn)假陽性或不穩(wěn)定問題時，我們可通過突變修飾進行改善等等。
試劑抗體也需要做人源化和Fc改造嗎？
試劑抗體人源化不是必須的，人源化抗體理論上可以避免人抗鼠抗體（HAMA）效應的產(chǎn)生，具體來講，將小鼠抗體進行人源化改造后，只有被改造抗體的CDR區(qū)是小鼠來源，抗體其他區(qū)域都是人源的。人源化抗體改造的目標是CDR移植，改造后的效果需要做大量實驗來驗證。同樣Fc的改造也不是必須的，這種抗體分子改造方法目的是實現(xiàn)穩(wěn)定性和功能性的改善。Fc改造是對抗體恒定區(qū)進行改造，是否需要Fc改造還要結合項目的具體應用場景來考慮。
菲鵬生物目前可提供完整的原料解決方案服務，如果您有免疫診斷試劑原料開發(fā)的需求，歡迎通過以下方式與菲鵬生物取得聯(lián)系！
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